服務(wù)目錄號：OGF-023

服務(wù)項目：對電離輻射危害有輔助保護作用

服務(wù)內(nèi)容：

原理

血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一，在一 定范圍內(nèi)，照射劑量與血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性成反比，恢復時間與血／組織中超氧化物歧 化酶（SOD）活性成正比，血／組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性可代表機體氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)受損的狀況。

O2－氧化羥基的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽，后者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色，在波長 530nm 處有最大吸收峰，可用分光光度法進行測定，當 SOD 消除 O2－后形成的亞硝酸鹽減少。

儀器與試劑

儀器 721 分光光度計、離心機、恒溫水浴、勻漿器 試劑

1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS） pH7.8、SOD 標準品、三氯甲烷、95%乙醇（v/v）、0.9%生理鹽水 10mmol/L 鹽酸羥胺 鹽酸羥胺 6.95mg，加 PBS 至 10mL 7.5mmol/L 黃嘌呤

黃嘌呤 11.41mg，加 0.1M NaOH 2.5mL 溶解，加 PBS 至 10mL 0.2mg/mL 黃嘌呤氧化酶

取 10mg/mL 黃嘌呤氧化酶 0.2mL 加冰冷 PBS 9.8mL 至 10mL 0.1%甲萘胺 取 0.2g α-甲萘胺溶于 40mL 沸蒸餾水，涼至室溫加 50mL 冰醋酸，再加 110mL 涼蒸餾水至 200mL 0.33%對氨基苯磺酸 取 0.66g 對氨基苯磺酸溶于 150mL 溫蒸餾水，加 50mL 冰醋酸至 200mL

實驗方法

實驗動物：小鼠，體重 18－22g，單一性別，每組 10－15 只。

劑量分組及受試樣品給予時間

實驗設(shè)三個劑量組和一個輻射模型對照組，以人體推薦量的 10 倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品于照射前給予 14－30 天，照射后仍然給予受試物，必要時可適當延長至 45 天。

實驗步驟

受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一 次，照射劑量宜選擇 6Gy－8Gy。于照射后第 7 天，進行實驗。

紅細胞抽提液制備：10μL 全血沖入 0.5mL 生理鹽水，2000r/min 離心 3min，棄上清，加冰冷的雙蒸水 0.2mL 混勻，加入 95%乙醇 0.1mL，振蕩 30s，加入三氯甲烷 0.1mL，置快速混合器抽提 1min，4000r/min 離心 3min，分層，上層為 SOD 抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷，記錄上清液體積待測。

組織勻漿的制備：剪取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，至玻璃勻漿器中加入 冷生理鹽水 20000r/min 勻漿 10s，間歇 30s，反復進行三次，制成 1%組織勻漿，（最好用超聲波發(fā)生器處理 30s），使線粒體振破，以中性紅－詹鈉氏綠 B 染色證明線粒體已振碎。以 4000r/min 離心 5min，取上清液 20μL待測。

SOD 標準抑制曲線 將 SOD 標準品用磷酸鹽緩沖液配制成 750U/mL 的溶液，再稀釋到 50 倍，即 SOD 量為 15U/mL（1.5μg/mL），用本法測定不同量的 SOD 標準液的百分抑制率，以百分抑制率為縱坐標，以 SOD 活力單位 U/mL 為橫坐標繪制標準曲線。

對照管 OD－測定管 OD

SOD 百分抑制率＝────────────────×100%

對照管 OD

計算

每 mL 反應(yīng)液中 SOD 抑制率達 50%時所對應(yīng)的 SOD 量為一個單位。              

（對照管 OD-測定管 OD） ×100%

對照管 OD

反應(yīng)液總量（6mL）

SOD 活力（U/mL）＝───────────────────────×──────────────×樣品稀釋倍數(shù)

50%                         取液量

也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從 SOD 標準曲線查出相應(yīng)的 SOD U/mL，乘以稀釋倍數(shù) （1mL/取樣量）。

若樣品為組織勻漿液，根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量，將單位換算為 U/g 組織或 U/mg 蛋白。若樣品為紅細胞抽提液，根據(jù)血紅蛋白含量，可換算為 U/g Hb。

樣品測定步驟：                                                                    

試劑                                   測定管                        對照管       

1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液 pH7.8（mL）      1.0                            1.0

樣品                                     A*

10mmol/L 鹽酸羥胺（mL）                0.1                            0.1

7.5mmol/L 黃嘌呤（mL）                 0.2                            0.2

0.2mg/mL 黃嘌呤氧化酶（mL）            0.2                            0.2

雙蒸水（mL）                           0.49                           0.49

混勻，25℃恒溫水浴 20min

0.33%對氨基苯磺酸（mL）                2.0                            2.0

0.1%甲萘胺（mL）                       2.0                            2.0

混勻 15min 后，倒入 1cm 光徑比色杯，以蒸餾水調(diào)零，530nm 處比色測定 OD 值。     

* A 所用樣品的量

紅細胞抽提液                                            10 μL

血清（或血漿）                                       20－30 μL（溶血樣品剔除）

1%組織勻漿                                             10－40 μL

數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

SOD 活性值為計量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算 F 值，F 值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。 任一劑量組與輻射模型對照組比較，血／組織中 SOD 活性增強，差異有顯著性，則可判定該實驗陽性。

血清溶血素實驗

原理

免疫系統(tǒng)是機體輻射損傷較敏感的組織之一，血清溶血素值可代表體液免疫系統(tǒng)的狀況。在一定范圍內(nèi)，照射劑量與血清中溶血素水平成反比，恢復時間與血清中溶血素水平成正比，血清中溶血素可代表機體體液免疫系統(tǒng)受損的狀況。

實驗方法

實驗動物：小鼠，18－22g，單一性別，每組 10－15 只。

劑量分組及受試樣品給予時間

實驗設(shè)三個劑量組和一個輻射模型對照組，以人體推薦量的 10 倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量 組，必要時設(shè)陽性對照組。受試樣品于照射前給予 14－30 天，照射后仍然給予受試物，必要時可適當延長 至 45 天。

實驗步驟

受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品，劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射 一次，照射劑量宜選擇 1Gy－3Gy。于照射后 20 天內(nèi)，進行血清溶血素的測定。（可任選下列方法之一）

血凝法

原理

用 SRBC 免疫動物后，產(chǎn)生抗 SRBC 抗體（溶血素），利用其凝集 SRBC 的程度來檢測溶血素的水平。

儀器和材料

SRBC、生理鹽水、微量血凝實驗板、離心機。

實驗步驟

SRBC 綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維， 放入 4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?2 周。

免疫動物及血清分離 取羊血，用生理鹽水洗滌 3 次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積 SRBC 用生理鹽水配成 2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射 0.2mL 進行免疫。4～5 天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約 1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min 離心 10min，收集血清。

凝集反應(yīng) 用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi)，每孔 100μL，再加入 100μL 0.5%（v/v）的 SRBC 懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于 37℃溫箱孵育 3h，觀察血球凝集程度。

血清凝集程度一般分為 5 級（0－IV）記錄，按下式計算抗體積數(shù)，抗體水平＝（S1+2S2+3S3……nSn） 式中 1、2、3……n 代表對倍稀釋的指數(shù)，S 代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。

0 級 紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰。

I 級 紅細胞大部分沉集在孔底成圓點狀，四周有少量凝集的紅細胞。

II 級 凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點。

III 級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。

IV 級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。

數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

抗體積數(shù)為計量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算 F 值， F 值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于模型對照組的抗體水平，可判定該項實驗結(jié)果陽性。

注意事項

血清稀釋時要充分混勻。最后一個稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

半數(shù)溶血值（HC50）的測定

原理

用 SRBC 免疫動物后，產(chǎn)生抗 SRBC 抗體（溶血素），與 SRBC 一起孵育，在補體參與下，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。

儀器和材料

721 分光光度計、離心機、恒溫水浴、SRBC、補體（豚鼠血清）、SA 緩沖液、都氏試劑（碳酸氫鈉 1.0g、 高鐵氰化鉀 0.2g、氰化鉀 0.05g，加蒸餾水至 1000mL）。

實驗步驟

SRBC 綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動，以脫纖維，放入 4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?2 周。

制備補體 采集豚鼠血，分離出血清（至少 5 只豚鼠的混合血清），將 1mL 壓積 SRBC 加入到 5mL 豚鼠血清中，放 4℃冰箱 30min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝，－70℃保存。用時以 SA 液按 1∶8 稀釋。

免疫動物及血清分離 取羊血，用生理鹽水洗滌 3 次，每次離心（2000r/min）10min。將壓積 SRBC 用生理鹽水配成 2%（v/v）的細胞懸液，，每只鼠腹腔注射 0.2mL 進行免疫。4～5 天后，摘除眼球取血于離 心管內(nèi)，放置約 1h，使血清充分析出，2000r/min 離心 10min，或 6000r/min，4min，收集血清。

溶血反應(yīng) 取血清用 SA 緩沖液稀釋（一般為 200～500 倍）。將稀釋后的血清 1mL 置試管內(nèi)，依次加入 10%（v/v）SRBC 0.5mL，補體 1mL（用 SA 液按 1:8 稀釋）。另設(shè)不加血清的對照管（以 SA 液代替）。置 37℃恒溫水浴中保溫 15～30min 后，冰浴終止反應(yīng)。2000r/min 離心 10min。取上清液 1mL，加都氏試劑 3mL，同時取 10%（v/v）SRBC 0.25mL 加都氏試劑至 4mL，充分混勻，放置 10min 后，于 540nm 處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。

溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下列公式計算，

樣品光密度值

HC50＝───────────────────────×稀釋倍數(shù)

SRBC 半數(shù)溶血時的光密度值

數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

血清溶血素含量為計量資料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算 F 值，F 值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。任一劑量組與輻射模型對照組比較，血清半數(shù)溶血值增多，差異有顯著性，則可判定該實驗陽性。

結(jié)果判定

在外周血中白細胞計數(shù)實驗、骨髓細胞 DNA 含量或骨髓有核細胞數(shù)實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗、血／組織中超氧化物歧化酶活性實驗、血清溶血素含量實驗中，任何兩項實驗結(jié)果陽性，可判定該受試樣品具有對電離輻射危害有輔助保護作用。